【好文推荐】载多柔比星透明质酸聚合物胶束的制备及其抗肿瘤活性

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前言

脂质体还可以通过化学修饰的方法增强其靶向性和药代动力学特性。在脂质体表面上连接具有肿瘤细胞靶向性的分子能使其更加有效地到达作用位点，其中最有前景的是糖类化合物透明质酸。因为透明质酸受体CD44 在多种肿瘤细胞表面表达比正常细胞中要高得多，这种受体与透明质酸能够紧密结合。在一项研究中，Rom 等证实了透明质酸确实能靶向性地引导阿霉素脂质体到达透明质酸受体CD44 高度表达的肿瘤细胞。他们发现，透明质酸介导的阿霉素脂质体到达白血病肿瘤细胞的浓度要明显多于游离阿霉素，表明用透明质酸介导的阿霉素脂质体能更有效地靶向治疗多种白血病。除化学修饰的方法外，还通过在脂质体中添加溶血卵磷脂，可以破坏肿瘤血管，增加阿霉素脂质体对深层肿瘤细胞的杀伤作用。

载多柔比星透明质酸聚合物胶束的制备及其抗肿瘤活性

邱立朋1,2，龙苗苗1，田晨敏3，李 玲3，陈大为1,3*

(1. 沈阳药科大学药学院，辽宁沈阳 110016；2. 江南大学药学院，江苏无锡 214122；3. 苏州大学药学院，江苏苏州 215123)

透明质酸(hyaluronic acid，HA) 是一种体内广泛存在的糖胺多糖，在维持细胞外基质结构及调节细胞内活动方面都起着重要的作用，其结构中有羧基、羟基和酰胺基，有利于载体材料的修饰[1]，因此在药物传递系统中应用广泛。HA 作为肿瘤靶向载体，主要通过受体介导作用，增加病灶区的药物浓度，达到靶向治疗的目的[2]。CD44 受体是肿瘤细胞表面最重要的HA 受体，是与HA 结合的主要部位。它可增强HA 与肿瘤细胞结合和内化的能力，对肿瘤血管的生成、肿瘤转移性及侵袭性等具有重要的调节作用[3]。

本课题组前期合成了透明质酸- 聚组氨酸(HPH) 两亲性载体材料，并考察了其pH 敏感特性及PHis 取代度对抗肿瘤活性的影响[9]。本研究在此基础上制备了载多柔比星(doxorubicin，1) 的聚合物胶束(1/HPH)，并考察其在不同肿瘤细胞及正常细胞中的体外抗肿瘤活性。

1 仪器与试药

JY92- Ⅱ DN 型超声波细胞破碎仪( 宁波新芝科器研究所)；NicompTM 380 型激光粒度电位测定仪( 美国PSS公司)；UV-2600 型紫外分光光度计( 日本Shimadzu 公司)；FE20型实验室pH 计( 梅特勒- 托利多仪器有限公司)；H-600

型透射电镜( 日本Hitachi 公司)；ELX808IU 型酶标仪( 美国Bio-Rad 公司)；FACSCalibur 型流式细胞仪( 美国BD公司)。

2 方法与结果

2.1 HPH 聚合物的pH 敏感性考察

称取HPH 聚合物50 mg 溶于蒸馏水20 ml 中，加入1 mol/L 盐酸调至pH 1.2，然后用0.01 mol/L氢氧化钠溶液缓慢滴定，记录滴定体积及pH 值。同时，以相同浓度的氯化钠为对照组进行滴定。重复试验3 次。以氢氧化钠溶液体积为横坐标，pH值为纵坐标绘制滴定曲线，结果见图1。由于组氨酸的咪唑基团同时具有质子化与去质子化的能力，在滴定过程中可不断结合、脱去质子，因此与氯化钠对照组相比，HPH 聚合物表现出一定的缓冲能力，具有pH 敏感的特性。

2.2 载药聚合物胶束的制备

称取1 盐酸盐50 mg，溶于丙酮∶甲醇(1 ∶ 1)4 ml 中，加入三乙胺25 μl，室温避光条件下搅拌(1 600 r/min)12 h，旋转蒸除有机溶剂后，加入蒸馏水搅拌过夜，过滤除去未脱盐的1 盐酸盐，冷冻干燥即得1。

2.3 粒径及ζ 电位

取适量胶束溶液，用PBS 稀释后，采用粒径电位测定仪测定粒径、粒度分布及ζ 电位值。结果表明1/HPH 胶束的平均粒径为(212.2±11.9)nm(n=3)( 图2A)，多分散系数(PDI) 为0.28±0.02，ζ 电位为(-11.91±0.66)mV(n=3)，说明制备的胶束粒径均一，表面的负电荷能防止胶束间的聚集。将载药胶束混匀后滴至覆有支持膜的铜网上，室温干燥后用透射电镜(TEM) 观察并拍摄照片( 图2B)。可见，1/HPH 胶束的形态呈类球形，分布较为均匀。

2.4 载药量及包封率

采用UV 法在479 nm 处测定1 的吸光度(D)。本试验中，1 浓度( c) 在1 ～ 32 μg/ml 范围内与D 线性关系良好，标准曲线方程为D=1.89×10- 2c–7×10-4，R2=0.999 8；低、中和高浓度( 2、12 和32 μg/ml) 样品的日内RSD 为2.1％、0.60％和0.27％，日间RSD 为2.67％、1.13％和0.44％ (n=5)；回收率RSD 为1.61％、0.50％和0.54％ (n=3)。

2.5 体外药物释放

采用动态透析法考察载药胶束的体外释放行为。精密量取聚合物胶束溶液2 ml，置透析袋( 截留相对分子量3 500) 内，扎紧袋口后投到pH 7.4、6.0和5.0 的PBS( 释放介质)20 ml 中，于(37±0.5)℃、100 r/min 振摇下试验。分别于1、2、4、6、8、12

和24 h 取样1 ml( 同时补充同温等量的新鲜释放介质)，在479 nm 处测定D 值，计算介质中药物含量和累积释放率。1/HPH 胶束在不同pH 值介质中的释放曲线见图3。

2.6 HPH 载体的细胞毒性

HPH载体对肿瘤细胞MCF-7 和A549 及正常成纤维细胞L929 均无明显毒性，细胞存活率都在90％以上，表明HPH 空白胶束的细胞毒性较低，可作为抗肿瘤药的传递载体。

2.7 载药胶束的毒性作用

1/HPH 胶束对CD44 受体高表达的肿瘤细胞具有较好的靶向作用，而对正常细胞的毒性较低，这可提高抗肿瘤药对肿瘤的疗效，降低对正常组织的不良反应。

2.8 载药胶束的细胞摄取

由图6 可见，MCF-7 细胞在3 个时间点的相对摄取速率都显著高于其他2 种细胞(P<0.05)；且相对摄取速率远大于100％，表明胶束经CD44 受体介导的内吞速率要大于游离药物的被动扩散速率。

3 讨论

两亲性的HPH 聚合物能在水性环境中自组装形成具有核壳结构的纳米胶束，其内核可通过疏水作用力包载疏水性小分子抗肿瘤药。所制备的胶束粒径约为200 nm，比文献报道的嵌段共聚物胶束的粒径稍大[9]，这可能是由于HA 链较长，疏水基团需要取代到一定程度后粒径才可能减小。之前的研究结果也表明，PHis 取代度对胶束粒径的影响较大[10]。此外，本研究制备的胶束载药量较高，原因是使用胶束包封疏水性的碱基1。因此，随着时间的延长，胶束与游离1 的荧光比值降低。对于L929 细胞，由于表面CD44 受体的表达量很低，

胶束和游离1 都是通过其他非竞争性方式入胞，因此，时间的延长对胶束的相对摄取速率影响不大。

作者简介：邱立朋(1984—)，男，博士，讲师，从事纳米靶向传递

系统研究。

E-mail：flyqlp@163.com

通信联系人：陈大为(1959—)，男，教授，博士生导师，从事肿瘤

靶向给药系统研究。

Tel：0510-85911900

E-mail：chendawei@syphu.edu.cn

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